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谈甜菜红苷对人结肠癌HT29 细胞凋亡的影响

来源:[db:来源] 编辑:admin 时间:2017-09-04
  一直以来,结肠癌居于各种恶性肿瘤发病率的第2 位和病死率的第4 位。目前,以氟尿嘧啶为基础的治疗方案仍是结肠癌的国际标准化疗方案,但由于化疗药物的耐药性和药物毒性,该类治疗方案的总体有效率仍不足40%,因此需要开发新药物来提高治疗有效率,同时降低不良反应。中药半枝莲又名太阳花,是马齿觅科马齿觅属一年生肉质草本植物,在我国各地广泛栽培,是典型的合成甜菜素类植物。半枝莲在传统医学中长期被用于治疗结、直肠癌,但其抗癌主要成分及机制至今仍不明确。有报道,半枝莲通过正交设计法优化提取物制备出的红色素,经溶解性观察、薄层色谱法和紫外可见光谱扫描分析证实,该红色素即为甜菜红素。而甜菜红素主要以甜菜红苷形式存在,提取率为7.44%。甜菜红苷作为半枝莲的主要提取物,具有较强的清除氧自由基、羟自由基、二苯代苦味酰基自由基的能力,具有较强的抗氧化、抗肿瘤功效。笔者拟探讨甜菜红苷的抗癌作用及机制,以期为后续研究提供试验依据。
  1 材料
  1.1 仪器
  PX-150B型生化培养箱(美国BD公司);RZ-9802 型酶标仪(天津瑞泽分析仪器有限公司);CR21 型高速冷冻离心机(日本Hitachi 公司);MCO-175 型细胞培养箱(日本Sanyo 公司);6HT2L 型流式细胞仪(美国Guava Easy Cyte 公司);RE-2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DLSB-5/20 型低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司);B-290 型实验室小型喷雾干燥机(瑞士Buchi 公司);GST-1 型聚合酶链反应(PCR)仪(英国Gstorm 公司);Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统、APC 300 型电泳仪(美国Bio-Rad 公司);DU-650 型蛋白核酸分析仪(美国Beckman公司)。
  1.2 药品与试剂
  甜菜红苷(郑州郑亚化工产品有限公司,批号:TC326540,纯度:99%);青霉素-链霉素溶液(批号:TBB002)、胎牛血清均购自上海尚善生物科技有限公司;Bcl-2 和Bax 抗体(美国CST公司);RPMI 1640 培养液、0.5%二甲基亚砜(DMSO,德国WAK公司);MTT(美国Sigma 公司);E-ELN-M0044 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司);AnnexinⅤ凋亡试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspase-9 试剂盒(美国Invitrogen 公司);实时荧光(RT)试剂盒、Trizol 洗细胞溶液、PCR 试剂盒(北京Promega 公司);Taq 聚合酶、RNase 抑制剂(大连宝生物工程有限公司)。
  1.3 细胞
  人结肠癌HT29 细胞(广州行知生物科技有限公司,批号:AA-CELL-103)。
  2 方法
  2.1 细胞培养
  HT29 细胞置于含10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素、100μg/ml链霉素的培养液中,在37 ℃、5%CO2条件下常规培养。
  2.2 细胞抑制率的测定
  取对数生长期的HT29 细胞,用RPMI 1640 培养液调整细胞密度至1×105 ml-1,接种于96 孔培养板中,每孔0.1 ml,移入培养箱中培养24 h 使细胞贴壁。以0(空白对照)、0.5、1、1.5、2、3 mg/ml 甜菜红苷培养细胞24 h;以1.5 mg/ml 甜菜红苷分别培养细胞0(空白对照)、1、3、6、12、24 h。药物培养结束后吸弃各孔中培养液,每孔加入0.1 ml MTT[含5%磷酸盐缓冲液(PBS)],在37 ℃下继续培养4 h。再吸弃各孔中培养液,加入0.5%DMSO 0.1 ml,振荡摇匀,室温放置10 min。以上试验每个质量浓度均设12 个复孔。在0.1 ml DMSO中发现蓝紫色的MTT甲臜沉淀物,使用ELISA 法以酶标仪于570 nm波长处测定光密度(OD),计算细胞抑制率(%)=(空白对照OD-试验OD)/空白对照OD×100%。


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