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谈全天麻胶囊中天麻的DNA鉴定

来源:[db:来源] 编辑:admin 时间:2017-09-07
  天麻为传统的名贵药材,隶属兰科(Orchidaceae)植物天麻Gastrodiaelata Bl. 的干燥块茎,为多年生草本植物,主产于四川、云南、贵州、陕西等地,天麻主要成分为天麻素及其苷元,具有广泛的药理作用,如镇静催眠、抗惊厥等[1]。因此,含天麻药材的中成药越来越多,如今药材掺伪现象极为普遍,市场上常见的假天麻紫茉莉根、大丽菊块根、芭蕉芋、马铃薯等,而药典中收录的中成药质量检测方法并不能有效的检测出某药材是否掺伪,随着分子生物学的发展,李相陵等采用CTAB法成功从天麻干品粉末中提取DNA,DNA纯度较好,产率较高,可用于分子生物学研究。本课题组陈蓉等已成功对中成药药材进行DNA技术鉴定,该方法特异性强,操作简单,检测速度快。因此我们基于该技术研究对中成药中天麻掺伪进行检测,采用全天麻胶囊作为考察对象(其制法为:取天麻粉碎成细粉,过筛,混匀或制成颗粒,装入胶囊即得)该胶囊只含天麻一种药材,且未经过提取纯化等工艺过程,方便天麻DNA的鉴定。
  1 材料和方法
  1.1 材料
  在药店随机购买某品牌的全天麻胶囊,胶囊内容物为药材细粉。全天麻对照药材购自中国药品生物制品鉴定所;批号为:HXRD-26DW。在市场上随机购买马铃薯。
  1.2 方法
  基因组DNA的提取采用CTAB法[4]提取天麻对照药材和全天麻胶囊的基因组DNA,将马铃薯切成块,然后使用液氮将其研磨成粉末,再使用相同的CTAB法提取马铃薯基因组DNA。放入4℃冰箱冷藏待用。
  1.3 引物的设计
  陶钧等采用RAPD方法研究了天麻的某个特异DNA序列为各种天麻所共有的,而它常见的伪品没有。该序列在GenBank中的序列号为AY905620,然后根据引物设计原则设计天麻扩增引物为T1:CCCATAGCCATCCAAATCTG,T2:GGTGATGATAAGGTATTGTAACGAT。才华等研究了UGpase引物为马铃薯PCR检测的特异引物,故设计马铃薯引物为M1:GGTGATGATAAGGTATTGTAACGAT,M2:AAGCAGCAAAATTGGATAGTAGGAG。引物序列发往上海生工生物公司合成,引物均稀释成25 μm。1.4 利用PCR扩增出目的条带引物特异性检测用以上制备的DNA模板进行PCR扩增,扩增总体积为50 μL,含40.5 μL H2O,10×缓冲液5 μL,dNTPS1 μL,模板(天麻对照药材基因组DNA)1 μL,T1引物1 μL(CCCATAGCCATCCAAATCTG),T2引物1 μL(GGTGATGATAAGGTATTGTAACGAT),Taq酶0.5 μL,混合后置PCR仪中反应。温度和时间参数为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸30s,循环35次,最后延伸7 min。在PCR管中加入40.5 μL H2O,10×缓冲液5 μL,dNTPS1 μL,模板(马铃薯基因组DNA)1 μL,M1引物1 μL(GGTGATGATAAGGTATTGTAACGAT),M2引物1 μL(AAGCAGCAAAATTGGATAGTAGGAG),Taq 酶0.5 μL,混合后置PCR仪中反应。温度和时间参数为:94℃预变性3min,94℃变性30 s,61℃退火45s,72℃延伸30 s,循环35次,最后延伸7 min。中成药检测:在PCR管中加入37.5 μL H2O,10×缓冲液5 μL,dNTPs 1 μL,模板(全天麻胶囊基因组DNA)4 μL,M1引物1 μL(GGTGATGATAAGGTATTGTAACGAT),M2引物1 μL(AAGCAGCAAAATTGGATAGTAGGAG),Taq 酶0.5 μL,混合后置PCR仪中反应。温度和时间参数为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,61℃退火45 s,72℃延伸30 s,循环40次,最后延伸7 min。取扩增产物7.5 μL于3%琼脂糖凝胶电泳15 min后,溴乙锭染色,在琼脂糖凝胶成像系统中检测和照相。


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